Test Report – Chinese

梅精膠囊八大營養標檢驗報告1

 

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國立虎尾科技大學

NATIONAL FORMOSA UNIVERSITY

 

生物科技系

 

 

農產品梅精抗癌細胞功效評估

 

 

 

 

指導教授:葉怡玲老師

NFMI105001

中華民國 105 年 3 月 4 日

 

備註:

  1. 本報告書內容未經授權不得轉移他用，無本實驗室戳章或經塗改、分離使用者 無效。
  2. 檢驗報告僅就委託者之委託事項提供檢驗結果，不對產品合法性做判斷。

摘要：

本實驗主要評估由優德企業社所提供的 P.mume 是否具有抑制大腸癌細胞之能力。我們利用人類大腸癌細胞 WiDr 細胞株及人類結腸腺癌細胞 Caco-2 細胞株來進行研究。

將 P.mume 粉末稀釋成不同的濃度(400 μg/ml、800 μg/ml、1200 μg/ml、1600 μg/ml 及

2000μg/ml)，之後利用 MTT assay 個別做三重複來評估細胞之存活率來觀察其對癌細胞的抑制作用。從實驗結果現象可看出，P.mume 的濃度越高，殺死的癌細胞也越多，經

過數據分析，優德企業社所提供之 P.mume 對 WiDr 細胞株的毒殺能力 IC50 為

1216.97μg/ml 而對 Caco-2 細胞株的毒殺能力 IC50 為 1243.39μg/ml，實驗結果證實優德

企業社所提供的 P.mume 具有毒殺 WiDr 及 Caco-2 癌細胞的功效。

 

關鍵詞：抗癌功效、MTT assay、Prunus mume、大腸癌

壹、前言：

  1. Prunus mume：5-hydroxymethylfurfural (HMF)的成分其具有抗過敏源之功效[2]，在另外在其他資料中還指出 P.mume 中含有 MK615[3,4]和 C19H22O6[5]兩種成分具抗腫瘤及抗氧化的功效[6]，顯示著中國古代就發現 P.mume 除了觀賞價值外，還具有保健及藥用的
  2. 功效。
  3. Prunus mume (縮寫 P.mume)，是薔薇科的落葉喬木，有時也指其果實或花。原產於中國，後來發展到韓國與日本等地[1]。在本草綱目中記載 P.mume 具有「消渴煩悶，泄痢口渴，產後痢渴，赤痢腹痛，便痢膿血，久痢不止，腸垢已出，大便下血，及酒痢、久痢不止，小便尿血，血崩不止，大便不通，氣奔欲死者，霍亂吐利，蛔蟲上行，出於口鼻，水氣滿急，心腹脹痛，短氣欲絕者，勞瘧劣弱，久咳不已，痰厥頭痛如破者，傷寒頭痛，壯熱，胸中煩痛，四、五日不解，折傷金瘡，馬汗入瘡作痛，犬傷毒，指頭腫毒痛甚者，傷寒瘡，生下部者，小兒頭瘡，香口去臭」等功效，而且在資料中文獻中還顯示 P.mume 中含有
  4. 大腸癌：
  5. 大腸直腸癌，又稱為大腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、結直腸癌、或腸癌，為源自結腸或直腸（為大腸的一部份）的癌症。因為細胞不正常的生長，可能侵犯或轉移至身體其他部。症狀可能包括糞便中帶血、排便習慣改變、體重減輕、以及疲倦感。大部份的大腸直腸癌起因為生活習慣及老化，少部分則因為遺傳疾病風險因子包括飲食、肥胖、抽菸、運動量不足。增加罹癌風險的飲食包含紅肉或加工肉品、以及酒精。其他風險因子包含發炎性腸道疾病也會造成大腸癌的發生。
  6. MTT 試驗:
  7. MTT 為黃色化合物，是一種接受氫離子的染料，可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶 (SDH)和細胞色素 C 的作用下 tetrazolium 環開裂，生成藍色的 formazan 結晶，formazan 結晶的生成量與活細胞數目成正比（死細胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將 MTT 還原）。可利用測 O.D.值得知細胞還原 MTT 的能力 (formazan 形成量)，此 O.D.值代表了粒線體的活性，即活細胞數目，故 MTT assay 可用作細胞存活率的指標。
  8. 研究目的： 觀察對象。
  9. 隨著經濟的復興，國人的飲食生活也產生了巨大的變化，現代人的飲食越來越奢華，且食品中的添加物也越來越多，使大腸癌變成國人罹患癌症的前三名。” 食物會改變人的體質”，國人體質所產生的變化剛好印證這項論點。本研究使用 P. mume 濃縮粉作為研究對象，是因為在我們歷史的悠久的飲食中，P. mume 是一個非常普遍且具有藥用功效的食物，而且在上述資料中顯示 P. mume 具有許多癌細胞毒殺效果，但在目前研究中，尚未有人進行關於 P. mume 毒殺大腸癌細胞的研究。故選用 P. mume 萃取物及大腸癌細胞 Caco-2 及 WiDr cell line，作為本實驗的

貳、實驗設計：

利用人類大腸癌細胞 WiDr 細胞株及人結腸腺癌細胞 Caco-2 細胞株，加入稀釋後不同濃度的 P. mume 溶液，分別為 400 μg/ml、800 μg/ml、1200 μg/ml、1600 μg/ml 及 2000 μg/ml，觀察其對細胞的毒殺作用。本實驗利用 MTT assay 做三重複來評估

細胞之存活率，再求出 IC50。

 

參、實驗器具及藥品：

一、P.mume：由廠商提供之 P. mume 粉末

  1. 實驗用細胞：        由財團法人食品工業研究所(台灣新竹)購入人類結腸癌細胞株(二)Caco-2 cells(BCRC 號碼：60182) 動物種別：人組織來源：結腸;大腸腺癌細胞形態：上皮細胞樣細胞生長：貼壁培養條件：DMEM 培養基，90%；胎牛血清，10%。
  2. (一) WiDr cells (BCRC 號碼：60157) 動物種別：人組織來源：結腸;大腸腺癌, 為杯狀細胞 HT-29 cell 的衍生細胞細胞形態：上皮細胞樣、多角形細胞生長：貼壁培養條件：MEM 培養基，90%；胎牛血清，10%。
  3. 實驗用設備：
  4. 站立式離心機                       (5922 Microprocessor,Kubota, Japan) 恆溫循環水槽                                   (Digisystem,Germany) 倒立式螢光顯微鏡                                     (Nikon,Japan) 二氧化碳培養箱                               (Heal force,Hong Kong) 紫外線/可見光光譜儀                                     (Metertech)
  5. 實驗用耗材：10ml 吸管                                               (Falcon,USA) 15 及 50ml 離心管                                        (Falcon,USA)
  6. 冷凍小管                                           (Corning® ,Mexico) 細胞計數盤                                       (Marienfeld,Germany) 96 孔盤                                             (NuncTm,Denmark)

五、實驗用藥品：

3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)

(Sigma,USA)

Antibiotic                                   (Biological Industries,Israel)

Dulbecco‟s Modified Eagle‟s Medium(DMEM)                 (Sigma,USA)

Dimethyl sulfoxide(DMSO)                                 (Sigma,USA)

Fetal bovine serum(FBS)                       (Biological Industries,Israel) Glouse                                       (Riedel-de Haën,Seelze)

HEPES                                       (PanreacAppliChem,USA)

Human transferrin                                         (Sigma,USA)

L-glutamin                                   (Biological Industries,Israel)

Minimum Essential Medium(MEM)                           (Sigma,USA)

Non-essential amino acid(NEAA)                 (Biological Industries,Israel)

Soudium Bicarbonate                             (Riedel-de Haën,Seelze)

Soudium Pyruvate                             (Biological Industries,Israel)

Trypan blue                                 (Biological Industries,Israel)

  1. mume粉末 (優德企業社提供)

 

 

肆、實驗材料方法：一、細胞培養

(一)、WiDr 培養基成份       MEM 粉末

Soudium Bicarbonate

Soudium Pyruvate

NEAA

Antibiotic

10%FBS

 

(二)、Caco-2 培養基成份     D-MEM 粉末

Soudium Bicarbonate

Glouse

Soudium Pyruvate

Human transferrin

DDwater     HEPES

L-glutamin

10% FBS

 

(三)、培養方法

先將培養基和 1xPBS 從 4℃冰箱中取出，放入 37℃水浴槽內回溫。從培養箱取出細胞並顯微鏡下觀察。將所有試劑及細胞放入無菌操作台。以 pipette aid 吸出 T75 中的廢液，用 3c.c. 1xPBS 清洗後吸出到廢液杯。再吸 10c.c 培養基到 T75 後，放到顯微鏡下觀察並放到培養箱繼續培養。

 

 

(四)、細胞繼代

先將培養基和 1xPBS 從 4℃冰箱中取出，放入 37℃水浴槽內回溫。從培養箱取出細胞並顯微鏡下觀察。將所有試劑及細胞放入無菌操作台。吸出 T75 中的廢液，用 3c.c. 1xPBS 清洗後吸出到廢液杯，再加入 2c.c trypsin，置於培養箱作用約 10 分鐘(37℃)。觀察細胞是否呈圓粒狀，往桌子輕敲使黏附在壁上的細胞脫落後，加入 2~3c.c. medium 終止 trypsin 作用。吸取細胞液到 15ml 的離心管，離心 5 分鐘、400G、4℃。離心完倒掉上清液，medium 回溶 2~3c.c，吹吸 50~100 次(使細胞不聚集一起)再取一點到 eppendorf 內做細胞計數。

(五)、P.mume 稀釋倍數 將 P.mume stock(5000μg/ml)以培養基個別稀釋成濃度 400 μg/ml、800 μg/ml、

1200 μg/ml、1600 μg/ml 及 2000μg/ml，每個濃度點配製 800μl。

 

二、MTT 試驗

(一)實驗濃度

取濃度 400、800、1200、1600、2000 (μg/ml)的 P.mume 進行細胞試驗

(二)實驗方法

取 96 孔盤，在孔盤上標註各個濃度點及控制組跟空白組，並在孔盤中種下

4×104cell/ml 的細胞，放在 37℃培養箱培養 24 小。24 小時後將培養基吸出，放入 P.mume 並將 P.mume 及細胞作用 24 小時，隔天取出 P.mume(並將其收集儲存)，加入 MTT 試劑作用 4 小時後再加入 DMSO 溶解結晶，即可以測出吸光值。

伍、實驗結果：

 

 

圖一、利用 WiDr 細胞做 MTT Assay 之細胞存活率結果圖

先以 P.mume 刺激 WiDr 細胞培養 24 小時，再利用 MTT Assay 測試其毒性結果，確認

WiDr 細胞之存活率，此實驗進行三重複

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

圖二、利用WiDr細胞做MTT Assay之細胞抑制率結果圖

利用圖一之結果，做出 P. mume 對 WiDr 的抑制結果圖，利用各個濃度點和控制組(CTL)

做比較，P<0.05*、P<0.01**、P<0.001***

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

圖三、利用 Caco-2 細胞做 MTT Assay 之細胞存活率結果圖

先以 P .mume 刺激 Caco-2 細胞培養 24 小時，再利用 MTT Assay 測試其毒性結果，確認

Caco-2 細胞之存活率，此實驗進行三重複

 

 

 

 

 

 

 

 

 

圖四、利用 Caco-2 細胞做 MTT Assay 之細胞抑制率結果圖

利用圖三之結果，做出 P.mume 對 Caco-2 的抑制結果圖，利用各個濃度點和控制組(CTL) 做比較，P<0.05*、P<0.01**、P<0.001***

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

陸、討論：

從結果圖得知，WiDr 細胞株與 Caco-2 細胞株在 1600μg/ml 及 2000μg/ml 的濃度皆有顯著抑制，從實驗結果現象可看出，P. mume 的濃度越高，殺死的癌細胞也越多，經過數

據分析，優德企業社所提供之 P. mume 對 WiDr 細胞株的毒殺能力 IC50 為 1216.97μg/ml 而對 Caco-2 細胞株的毒殺能力 IC50 為 1243.39μg/ml，實驗結果證實優德企業社所提供的P.mume具有毒殺WiDr及Caco-2癌細胞的功效。已有文獻指出：C19H22O6 (2-hydroxy-1-

[(7-hydroxy-2-oxo-2H-chromen-6-yl)methyl]-2-methylpropyl-(2Z)-3-methyl-but-e-enoate:pru

nate) 是一種從 Prunus mume 萃取出來的化合物，它可以殺死 HEP-2 (人喉癌細胞)、 SK-OV-3 (人卵巢腺瘤細胞)、SW-156(腎癌細胞)及 HEC-1-B(人子宮內膜癌細胞)四種癌細胞，實驗結果說明在 100μg/ml 的濃度下化合物 C19H22O6 會抑制 81-96％的癌細胞，其 IC50 的值約介於 39~58μg/ml。[4] 由於廠商提供給我們的 P. mume 粉是混合物，而文獻中的 C19H22O6 為萃取出的化合物，兩者相比下 C19H22O6 只需要 100 μg/ml 就能有效殺死癌細胞，而我們的研究結果也證實了 P. mume 能殺死癌細胞，雖然確切的機制尚未進一步進行，但在未來或許能朝向機制探討或者動物實驗做更深入的研究。

 

陸、參考文獻：

[1]. 史新龍、馬家馳、楊熊飛、顧遠暉、李一平。(2012) 白細胞介素 1 細及其受體拮抗劑對大腸癌細胞增殖、侵襲的影響。中國普通外科雜誌, 21 (10) 1231-1235

[2]              WuSF, Chen YH, LinCL, Yang JC, DuYC, LeeJJ, WuYCand ChangFR, (2011)

Qualitative and Quantitative Analyses of the Anti-Allergic Constituent of CommercialPrunus mumeProducts in Taiwan.Journal of Food and Drug Analysis, JFDA

[3]. Sunaga N, Hiraishi K, Ishizuka T, Kaira K, Iwasaki Y, et al. (2011) MK615, A Compound Extract from the Japanese Apricot “Prunus mume”Inhibits In vitro Cell Growth and Interleukin-8 Expression in Non-small Cell Lung Cancer Cells. J Cancer Sci Ther S11:002. doi:10.4172/1948-5956.S11-002

[4].                Tada KI, Kawahara KI, Matsushita S, Hashiguchi T, Maruyama I, Kanekura T

(2012) MK615, a Prunus mume Steb. Et Zucc („Ume‟) Extract, Attenuates the Growth of A375 Melanoma Cells by Inhibiting the ERK1/2-Id-1 Pathway. Phytother Res. 26,833-8.

[5]. JEONG JT, MOON JH, PARK KH, SHIN CS (2006),Isolation and Characterization of a New Compound from Prunus mume Fruit that Inhibits Cancer Cells,J.Agric. Food Chem. 54, 2123-2128

[6]. Jiayi Shi,Jinyan Gong,Ji‟er Liu,Xiaoqin Wu,Ying Zhang,et al.(2009),Antioxidant capacity of extract from endible flowers of Prunus mume in China and its active compenents,LWT-Food Science and Technology,42,477-482